微分干涉对比（DIC）显微镜是如何工作的？

DIC显微镜是一种使用偏振滤光器和沃拉斯顿棱镜的传统宽视场显微镜。

光源散发出的光会穿过滤光器，变成45°的偏振光。在穿过沃拉斯顿棱镜后，光会被分成垂直偏振分量，其中一个为0°偏振，另一个为90°偏振。聚光镜将光聚集在标本上，再由2束偏振角度不同的连贯平行光线照射到标本上。光线穿过不同的光路长度，因为其穿过样本的路径上可能存在厚度或折射率差异。
最后的结果是，一条光线相对于另一条光线出现相移。垂直偏振光通过物镜和另一个沃拉斯顿棱镜后，重新组合成135°偏振光。根据光路长度的不同，这两束光线的干扰会产生建设性（增亮）或破坏性（变暗）干扰，使得原本用明场显微镜几乎观察不到的结构现在可通过DIC显微镜观察到。
最后，偏振滤光器（也称为分析仪）会将未发生任何相移的直接透射光滤除，其只允许135°的偏振光通过。

微分干涉对比 （DIC） 显微镜

使生物标本的未染色透明结构可见，这些结构在明场照明下难以看到

本文解释了当使用显微镜对透明、未染色的生物标本进行成像时，微分干涉对比 （DIC） 如何成为明场照明的良好替代方案。标本的明场图像通常缺乏结构和细节，因为局部吸收光的强度变化很小。染色确实会在通过标本后引起光强度的差异，但染色通常可能是有毒的。DIC显微镜利用光程长度和相移的梯度，使透明结构可见。

未染色的标本在明场显微镜中通常看起来不显眼且细节不足。但实际上，它们与醒目的光相互作用，并发生人眼无法检测到的相移。染色会导致振幅偏移和通过的光强度的差异，但大多数情况下，这仅适用于死材料。引起光波振幅变化的标本或其结构称为振幅物体[1]。

微分干涉对比（DIC）显微镜利用光程长度和相移的梯度，使相位物体在用显微镜观察时可见[2]。当光通过时引起相移的标本或其结构称为相位物体[1]。通过这种方式，可以以足够的对比度和分辨率观察活细胞和生物体。DIC产生类似浮雕的图像，其中标本的结构和特征似乎投下了阴影。它们没有光晕伪影，并且由于光学切片的可能性，也可以对相对较厚的标本进行成像。

DIC显微镜技术最早由弗朗西斯·史密斯（Francis Smith）于1947年发明，但随后由乔治·诺马尔斯基（Georges Nomarski）于1952年进一步发展并成为实用的显微镜方法[2]。

对于DIC显微镜，仅使用偏振光来照亮标本。偏振光分散成两条不同的光线，它们位于偏振的正交平面上。这两条光线彼此非常接近。当它们在样品内以不同的方式经历折射或散射时，就会发生不同的相移。如果这些光线重新组合，它们会相互干扰。光现在是椭圆偏振的。这种偏振可以通过分析仪转换为振幅偏移。通过这种方式，可以使波长在1/200（使用相机时甚至为1/1000波长）与整个波长之间的波长差异的相移可见。

明场DIC公司

图 1：使用明场和 DIC 对比度成像的神经元。

对于非偏振光，光波相对于其传播轴在所有方向上振荡。然而，在线性偏振光中，所有波振荡都具有相同的偏振角度或偏振平面。圆极化是另一种可能的极化类型。光波振荡遵循圆周运动并具有稳定的值，而方向则以恒定的角速度变化。椭圆偏振光是线性偏振光和圆偏振光的混合物。

偏振光可以由称为偏振器的材料或设备产生。如果类似的组件用于确定振动平面，则称为分析仪。有吸收式偏振片和分束偏振片。

图 2：偏振光示例：线性、圆周或椭圆偏振波（黑色）的组成，由线性偏振分量（红色和灰色）叠加而成。

在DIC显微镜中，偏振光是通过放置在聚光镜前面的偏振器产生的。这种偏振光通过DIC棱镜分裂成两条具有垂直偏振平面的线偏振光，DIC棱镜更广为人知的是沃拉斯顿棱镜。沃拉斯顿棱镜可以在聚光镜的平面上找到。标准的沃拉斯顿棱镜由双折射材料的两个楔块制成，它们在其底座上粘合在一起，并且光轴平行于外表面并相互垂直。

图 3：在 Wollaston 棱镜的部分中，45° 偏振光被分成两条垂直偏振光线，角度分别为 0° 和 90°（左）。棱镜的第二部分随后根据偏振改变它们的色散（右）。两条光线在通过聚光镜后变得平行。

通过该棱镜的偏振光被剪切成两个间隔很近的波，具有不同的偏转角度：普通波和非凡波。它们具有垂直的偏振平面，对于这两个波，介质的行为就好像它实际上具有单个折射率一样。波前的剪切发生在位于两个棱镜之间折射率结点的干涉平面上。光波在空间上被剪切角分开。对于整个棱镜上所有匹配的光波，它们的方向和它们之间的距离是相同的。这两个波之间的空间必须小于显微镜的分辨率极限。

因此，试样被紧密间隔的光波对照亮，这些光波与横向位移平行进入。如果这两种光波与具有不同折射率或不同厚度的试样部分相互作用，则当它们从试样中出现时，它们的光程长度会有所不同。光程长度是光路上两点之间的折射率和厚度的乘积。它与传输时间和光速有关。由于光程长度与光的传输时间有关，因此两个匹配的光波之间会发生相移。

在光波穿过标本后，它们通过另一个沃拉斯顿棱镜重新聚集在一起。现在它们相互干扰，形成椭圆偏振光，然后通过分析仪。只有具有明显偏振平面的光才能通过，因此，对于不同的光波会产生不同的振幅。相移被转换为振幅偏移，从而导致生成的图像中具有不同的光强度。

对于现代DIC显微镜，沃拉斯顿棱镜经常被修改。一个例子是Nomarski棱镜。它也由两个双折射楔块组成，但只有一个楔块与沃拉斯顿棱柱中的楔块相同。另一个是修改的，光轴是倾斜定位的。这种差异导致位于棱镜之外的干涉面。因此，棱镜可以位于物镜的孔径平面之外，使DIC更易于使用。

对于DIC显微镜，相邻物体点的相移差异有助于图像的形成。试样的细节在折射率或厚度方面具有梯度，可以更清晰地显示出来。由于光束彼此垂直偏振，因此通过旋转显微镜载物台可以看到图像的差异。

在进行DIC显微镜检查时，请务必记住不要使用塑料基材、载玻片或盖玻片和标本，因为许多聚合物对光具有去偏振作用，并且经常会扭曲对比度。

图 4：非偏振光通过偏振滤光片，然后以 45° 偏振。通过渥拉斯顿棱镜后，光被分离成垂直的偏振分量，一个偏振度为0°，另一个偏振度为90°。随后，聚光镜将光线引导通过样品。样品由两条具有不同偏振的相干平行光线照射。这基本上会产生两个略微偏移的样品明场图像，一个是 0°，另一个是 90° 偏振光。由于光的偏振不同，这些图像不会产生建设性或破坏性干扰。分离的光线经历不同的光程长度，因为它们穿过样品的点的厚度或折射率可能存在差异。这导致一条射线与另一条射线相比发生相移。垂直偏振的光线穿过物镜后，以135°重新组合成一条偏振光。根据光程长度的差异，两种光线的干涉现在会导致标本区域变亮或变暗，从而使结构看起来在明场照明下几乎看不到。最后，直接透射的光（没有发生任何相移）被 135° 偏振滤光片（也称为分析仪）去除。

图5（从左到右）：小鼠纤维质体（结缔组织细胞）、Transdescantia（野花）和Micrasterias（绿藻）的DIC图像。图6：用具有不同分裂角度的沃拉斯顿棱镜记录的秀丽隐杆线虫（蛔虫）的DIC图像。